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動物布魯氏菌病競爭ELISA抗體檢測試劑盒
發布時間:2017-09-06|編輯:悅洋生物

一、研發背景

布魯氏菌病是由布魯氏菌(Brucella)引起的以流產和發熱為特征的人獸共患病,嚴重地威脅著人和多種動物的生命健康。世界動物衛生組織(OIE)將布魯氏菌病列為B 類動物疫病,中華人民共和國動物防疫法將其列為二類動物疫病。隨著動物養殖規模和肉類加工數量的增加,以及冷鏈物流稱為一種趨勢,布魯氏菌病的傳染以及病原大范圍地傳播稱為一種潛在的威脅,因此布魯氏菌病的診斷也顯得越來越迫切。
布魯氏菌病的檢測方法主要有凝集試驗、補體結合試驗、熒光偏振試驗和PCR檢測等,但是這些方法在一定程度上都不及ELISA方法所具備的敏感性、特異性、方法標準化、穩定性、實驗結果直接客觀、可商品化為試劑盒等緊密聯系生產實際的優點。另外,傳統的血清學診斷方法常常出現假陽性血清反應而干擾診斷的判定。因此,在原有診斷方法的基礎上,建立一種更加敏感和精確的布魯氏菌病診斷方法,顯得尤為重要。
悅洋的技術骨干通過長期的投入研究,經過堅持不懈地努力,在GMP車間驗收成功之際,將建立的一種快速、高效、準確的動物布魯氏菌病的診斷方法進行了工藝上的優化,進一步生產出了性能穩定的動物布魯氏菌病競爭ELISA抗體檢測試劑盒,在 產業化調試中取得了實質性進展。
該試劑盒使用了一種能與布魯氏菌特異性結合的單克隆抗體,在布魯氏菌病抗體檢測中,該單克隆抗體能與布魯氏菌產生的抗體特異地競爭,而與其他病原細菌的抗體無競爭性,特別是與布魯氏菌有強烈交叉反應的小腸結腸炎耶爾森氏菌O:9和大腸桿菌O:157抗血清無競爭性,有效地解決了目前商品化布病競爭ELISA試劑盒無法區分小腸結腸炎耶爾森氏菌O:9和大腸桿菌O:157干擾的技術缺陷,提高了檢測的特異性。本試劑盒使用了對豬、牛、羊均具有良好反應原性的豬種布魯氏菌(S2株)脂多糖(LPS)作為包被抗原,不僅提高了LPS的產量,而且提高了檢測的敏感性,同時做到用一個試劑盒檢測多種動物布病抗體的目的。

二、試劑盒組分

商品名稱:動物布魯氏菌病競爭ELISA抗體檢測試劑盒
主要組分:抗原包被板,陽性對照血清,陰性對照血清,單克隆抗體、HRP標記羊抗鼠IgG,羊抗鼠酶標抗體稀釋液,樣品稀釋液,20倍濃縮洗滌液,底物顯色液A,底物顯色液B,終止液,封板膜,說明書。        

三、試劑盒的特點

該試劑盒具有簡便、快速、靈敏、特異和高通量等特點,適合基層養殖人員和技術人員使用。
可用于檢測牛、羊、豬等動物的布魯氏菌血清抗體,有利于養殖場對該病的防控。
試劑盒重復性好,批間變異系數小,特異性良好,敏感性高。

四、試劑盒敏感性試驗

將1:20稀釋的由琥紅平板試驗和補體結合試驗共同鑒定的陽性參考血清從1:2開始倍比稀釋到1:32,每個稀釋度分別取50μl加到抗原包被孔中,再加入50μl按照試劑盒稀釋的單克隆抗體。陽性參考血清1:32倍稀釋后其抑制率(PI)均≥30%。同時設強陽性血清對照、弱陽性血清對照、陰性血清對照和空白對照。每個樣品均做2個重復孔。強陽性對照血清PI均在82%~103%;弱陽性對照血清PI均在33%~70%;陰性對照血清PI均在10%~15%;空白對照OD450nm在2.5~2.9之間。
將1:20稀釋的由琥紅平板試驗和補體結合試驗共同鑒定的10分布魯氏菌陽性參考血清從1:20-1:2560倍比稀釋后,用悅洋布魯氏菌cELISA抗體檢測試劑盒進行敏感性試驗,結果檢出陽性最大稀釋倍數為640~1280(表1),表明試劑盒有很好的敏感性,符合臨床診斷試劑盒的要求。        

表1 cELISA試劑盒對不同稀釋度陽性血清的檢測結果

五、試劑盒特異性試驗

以小腸結腸炎耶爾森菌O:9、大腸桿菌O:157和沙門氏菌陽性血清,以及陰性參考血清10份,作為樣品進行cELISA檢測,驗證試劑盒的特異性。
結果試劑盒檢測小腸結腸炎耶爾森菌O:9、大腸桿菌O:157、沙門氏菌陽性血清,其PI均小于10%;檢測牛布魯氏菌陽性血清PI大于90%(表2);檢測牛布魯氏菌陰性血清的PI小于5%,全部為陰性(表3)。同時比對2個不同廠家生產的布病cELISA試劑盒,檢測結果不能有效區分小腸結腸炎耶爾森菌O:9陽性血清及大腸桿菌O:157陽性血清(表4、表5)。因此,廣州悅洋生物技術有限公司生產的動物布魯氏菌病競爭ELISA抗體檢測試劑盒,可以用于布魯氏菌抗體的臨床檢測。        

表2 悅洋布魯氏菌病cELISA檢測試劑盒特異性試驗檢測結果

注:2個陰性對照血清重復測定孔的平均OD450nm應≥2.0;2個陽性對照血清重復測定孔的平均OD450nm應< 0.2,且PI平均值應≥90%時,試驗成立。PI=(陰性對照OD450nm-檢測樣品OD450nm)/陰性對照OD450nm×100%。結果判定:血清樣本的PI≥30%時,判為陽性;當血清樣本的PI< 30%時,判為陰性。

六、試劑盒重復性試驗

隨機抽取5份血清樣本,做cELISA檢測,驗證試劑盒的重復性。批內重復性試驗的CV值為1.5%~7.9%(表6);批間重復性試驗的CV值為3.6%~9.0%(表7),批內重復性和批間重復性結果都符合規定的CV值小于15%的要求。        

表6  悅洋動物布魯氏菌病cELISA批內重復性試驗
表7 悅洋動物布魯氏菌病cELISA批間重復性試驗

與此同時,我們還做了針對不同動物的布魯氏菌病抗體檢測,試驗結果表明,悅洋公司的動物布魯氏菌病cELISA試劑盒可以檢測豬、牛、羊的布魯氏菌病抗體。
綜上所述,悅洋公司的動物布魯氏菌cELISA抗體檢測試劑盒特點如下:
a.敏感性強,陽性血清用琥紅平板試驗和補體結合試驗檢測到的最大稀釋度為
1:32,用本試劑盒檢測相同的陽性血清,稀釋640倍依然可以檢測出結果;
b.可以做到一個試劑盒檢測豬、牛、羊等不同動物的布魯氏菌病抗體;
c.本試劑盒最大的特點就是有效地解決了目前商品化試劑盒無法區分小腸結腸
炎耶爾森氏菌O:9和大腸桿菌O:157抗體的短板,提高了檢測的特異性;
d.批內和批間的重復性實驗表明該產品重復性極好,CV值控制在10%以內。

七、總結

目前布魯氏菌病在世界廣泛傳播,加上本病是人畜共患病,感染動物是人類的主要傳染源,因此對布魯氏菌病的準確檢測,及時切斷傳染源,對養殖場的疫病防控以及阻斷動物與人之間的傳播有著重要的公共衛生意義。
用本試劑盒對臨床上不同地區、不同動物的306份血清進行了檢測,同時與其他幾種檢測方法相比較,結果再次證明,本試驗方法較其他檢測方法有更高的敏感性和特異性,并且與其他商品化的間接法ELISA試劑盒比較,可以排除革蘭氏陰性細菌引起的假陽性。
悅洋生物動物布魯氏菌cELISA抗體檢測試劑盒具有敏感性高、特異性好、操作簡便、檢測時間短,并可大批量檢測等優點,很適合于布魯氏菌病的臨床監測,可以更精確的判定、更有效地對布魯氏菌病進行監測、防控。幫客戶解決農場存在的布魯氏菌病難題,為動物種群的健康保駕護航。
悅洋致力成為全球動物疾病體外診斷新生代產業領導者,因此,我們的使命就是研發和生產出高品質的產品,提供高品質的服務,幫客戶提升動物疾病防治水平,使動物和人健康,實現動物與人類和諧共生。

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